Durante los últimos cincuenta años muchos esquemas han sido desarrollados para el análisis sensorial del pescado crudo. El primer método, moderno y detallado, fue desarrollado por la Estación de Investigaciones Torry (Shewan et al., 1953). La idea fundamental era que cada parámetro de la calidad es independiente de otros parámetros. Posteriormente, la evaluación fue modificada recolectando un grupo de características distintivas para ser expresadas en puntuación. Esto proporciona un valor para un amplio rango de características. Hoy en día en Europa, el método más comúnmente usado para la evaluación de la calidad en el servicio de inspección y en la industria pesquera es el esquema UE, introducido en la Decisión del Consejo No 103/76 enero de 1976 (Cuadro 5.2). Existen tres niveles de calidad en el esquema UE: E (extra), A y B; donde E corresponde a la mayor calidad y por debajo del nivel B el producto no es apto para el consumo humano. El esquema UE es comúnmente aceptado en los países de la Unión Europea para la evaluación sensorial. Existen, sin embargo, algunas discrepancias dado que el esquema no toma en consideración las diferencias entres especies, puesto que sólo utiliza parámetros generales. Una sugerencia para modificar el esquema UE aparece en la Guía Políglota sobre los Grados de Frescura UE para Productos Pesqueros (Howgate et al., 1992), en la cual se desarrollan esquemas especiales para pescado blanco, cazón, arenque y caballa (Apéndice E).
Un nuevo método, el Método del Indice de la Calidad (MIC), desarrollado originalmente por la unidad de Investigación de Alimentos de Tasmania (Bremner et al., 1985), se usa actualmente en el Laboratorio Lyngby (Jonsdottir, 1992) para el bacalao, el arenque y el carbonero; frescos y congelados. En los países nórdicos y Europa, también ha sido desarrollado para la gallineta nórdica, la sardina y el lenguado.
Cuadro 8.1 Esquema para la evaluación de la calidad empleado para identificar el índice de calidad mediante deméritos (Larsen et al., 1992)
| Parámetro de la calidad | Característica | Puntuación (hielo/agua de mar) |
| Apariencia general | Piel | 0 Brillante, resplandeciente |
| 1 Brillante |
| 2 Opaca |
| Manchas de sangre (enrojecimiento) en opérculos | 0 Ninguna |
| 1 Pequeños, 10-30% |
| 2 Grandes, 30-50% |
| 3 Muy grandes, 50-100% |
| Dureza | 0 Duro, en rigor mortis |
| 1 Elástico |
| 2 Firme |
| 3 Suave |
| Vientre | 0 Firme |
| 1 Suave |
| 2 Estallido de vientre |
| Olor | 0 Fresco, algas marinas/metálico |
| 1 Neutral |
| 2 A humedad/Mohoso/ácido |
| 3 Carne pasada/rancia |
| Ojos | Claridad | 0 Claros |
| 1 Opacos |
| Forma | 0 Normal |
| 1 Planos |
| 2 Hundidos |
| Branquias | Color | 0 Rojo característico |
| 1 Pálidas, descoloridas |
| Olor | 0 Fresco, algas marinas/metálico |
| 1 Neutral |
| 2 Dulce/ligeramente rancio |
| 3 Hedor agrio/pasado, rancio |
| Suma de la puntuación |
| (Mínimo 0 y máximo 20) |
El MIC se basa en los parámetros sensoriales significativos del pescado crudo, cuando se emplean muchos parámetros, y un sistema de puntuación por deméritos del 0 al 4 (Jonsdottir, 1992). El MIC utiliza un sistema práctico de calificación en el cual el pescado se inspecciona y se registran los deméritos correspondientes. Las puntuaciones registradas en cada característica se suman para dar una puntuación sensorial total, el denominado índice de la calidad. El MIC asigna una puntuación de cero al pescado muy fresco; así, a mayor puntuación mayor es el deterioro del pescado. La descripción de la evaluación para cada parámetro se indica en una directriz. Por ejemplo: O puntuación por deméritos, en la apariencia de la piel en el arenque, significa una piel brillante característica del arenque recién capturado. La apariencia de la piel en un estado avanzado de deterioro se vuelve menos brillante, opaca y se le asigna una puntuación de 2 deméritos. La mayoría de los parámetros escogidos son iguales a muchos otros esquemas. Después de la descripción literal, las puntuaciones para cada descripción y para todos los parámetros, son clasificadas dando puntuaciones 0-1, 0-2, 0-3 o 0-4. A los parámetros de menor importancia se les asigna una clasificación menor. Las clasificaciones individuales nunca exceden 4, de esta forma ningún parámetro puede desbalancear la clasificación. En el Cuadro 8.1, se muestra un esquema para arenque; se enfatiza en la necesidad de desarrollar nuevos esquemas para cada especie (véase el esquema para bacalao en el Apéndice D).
Existe una correlación linear entre la calidad sensorial (expresada como una puntuación por deméritos) y la duración del pescado en hielo, la cual hace posible predecir el tiempo de vida remanente en hielo. La curva teórica de deméritos tiene un punto fijo en (0,0) y su máximo se fija como el punto donde el pescado ha sido rechazado por evaluación sensorial, por ejemplo, el producto cocido (véase Escala estructurada), o también puede determinarse como el tiempo máximo de almacenamiento. En las evaluaciones de productos cocidos, las dos pruebas sensoriales paralelas requieren de un panel sensorial experimentado (aunque sólo es necesario mientras se desarrolla el esquema), posteriormente no será necesario evaluar el pescado cocido a fin de predecir el tiempo de vida remanente. El MIC no sigue el patrón de la curva en S, tradicionalmente aceptado para el deterioro en almacén del pescado enfriado (Figura 5.1). La meta es obtener una línea recta que permita distinguir entre el pescado al inicio de la fase de meseta y el pescado cerca del final de la fase de meseta (Figura 8.2).
Figura 8.2 Combinación de curvas sensoriales para pescado crudo S(T) y cocido
En la Figura 8.2, cuando un lote de pescado alcanza la suma de 10 puntos de deméritos, el tiempo de almacenamiento remanente en hielo será de 5 días. Para predecir el tiempo de duración remanente, la curva teórica puede ser convertida según se muestra en la Figura 8.3.
Figura 8.3 Curva para predecir el tiempo de almacenamiento remanente para arenque almacenado en hielo o agua de mar a 0 °C
El comerciante de pescado quizá desee saber cuánto tiempo su compra permanecerá aceptable para la venta, si el pescado es almacenado inmediatamente en hielo. El comprador del mercado de pescado puede estar interesado en el número equivalente de días en hielo (donde el pescado ha sido almacenado desde su captura) a fin de estimar el tiempo remanente de mercadeo en hielo.
Escala estructurada
También pueden emplearse pruebas descriptivas para determinar la calidad, y efectuar estudios de duración en almacén, aplicando el método de escala estructurada. Las escalas estructuradas proporcionan al panelista una escala con diferentes de grados de intensidad. Se seleccionan algunos atributos detallados, generalmente sobre la base del trabajo de un panel descriptivo altamente entrenado. Las palabras descriptivas deben ser seleccionadas cuidadosamente y los panelistas deben ser formados para que pueda existir acuerdo en los términos. Deben emplearse términos objetivos en lugar de términos subjetivos. De ser posible, deben incluirse estándares en varios puntos de la escala. Esto puede efectuarse fácilmente con diferentes concentraciones de sales, pero puede resultar más difícil con condiciones como el grado de deterioro. El método más simple (Cuadro 8.2) puede ser 1). No hay olores ni sabores objetables, 2). Ligeros olores y sabores objetables y 3). Severos olores y sabores objetables, en donde el limite de aceptabilidad está entre 2 y 3. Esto ha sido posteriormente desarrollado en una evaluación integrada de filete de pescado magro y graso cocido (véase Apéndice E).
Se usa una escala de 10 puntos, según lo descrito en la Sección 5.1 -Cambios sensoriales, y se evalúa de forma integrada la impresión general sobre el olor, sabor y textura. Para el análisis estadístico puede emplearse la prueba "t" o el análisis de varianza (véase ejemplo en el Apéndice F).
Cuadro 8.2 Evaluación de pescado cocido
| Grado | Puntuación |
| Aceptable | Ausencia de olores/sabores Objetables | I | Olor/sabor característico de la especie Muy fresco, algas marinas Pérdida de olor/sabor Neutral | 10
9
8
7
6 |
| Ligeros olores y sabores objetables | II | Ligeros olores y sabores objetables como a humedad/moho, ajo, pan/levadura, ácido, frutal, rancio | 5
4 |
| Límite de aceptación |
| Rechazo | Severos olores y sabores objetables | III | Fuertes olores y sabores objetables a col vieja, NH3, H2S o sulfuros | 3
2
1 |
Evaluación de la calidad de los productos pesqueros
La evaluación de los productos pesqueros puede ser realizada mediante una prueba discriminativa o mediante una prueba descriptiva.
Prueba triangular
La prueba discriminativa más empleada en el análisis sensorial de pescado es la prueba triangular (Norma ISO 4120 1983), la cual indica si existe o no una diferencia detectable entre dos muestras. Los asesores reciben tres muestras codificadas, se les dice que dos de las muestras son idénticas y una es diferente, y se les solicita identificar la muestra diferente.
El análisis de los resultados de la prueba triangular se efectúa comparando el número de identificaciones correctas con el número que se esperaría obtener sólo por casualidad. La tabla estadística del Apéndice A debe ser consultada a fin de probar los resultados estadísticamente. El número de identificaciones correctas es comparado con el número esperado mediante el uso de tablas estadísticas, por ejemplo, si el número de respuestas es 12, 9 de las respuestas deben ser correctas a fin de obtener un resultado significativo (con un nivel del 1 por ciento).
La prueba triangular es de utilidad para determinar, por ejemplo, si la sustitución de ingredientes produce una diferencia detectable en el producto. La prueba triangular generalmente se emplean para seleccionar los asesores del panel de degustación.
Las muestras marcadas con A y B pueden ser presentadas de seis formas diferentes:
Igual número de seis posibles combinaciones son preparadas y servidas a los miembros del panel. Ellas deben ser servidas aleatoriamente, preferiblemente como duplicados. El número de miembros en el panel no debe ser menor de 12 (en el Apéndice B se muestra un ejemplo de la prueba triangular de la Norma ISO)
Cuadro 8.3 Ejemplo de una hoja de puntuación: Prueba triangular
| PRUEBA TRIANGULAR |
| Nombre: | Fecha: |
| Tipo de muestra: |
|
| Dos de estas muestras son idénticas, la tercera es diferente. |
| Examine las muestras de izquierda un círculo el número de la muestra diferente. Es esencial que efectúe a derecha y encierre en que usted considere es una selección (adivine sino encuentra una diferencia aparente) |
| Muestra de prueba No: |
|
| Describa la diferencia: |
|
Calificación (ordenación)
En un ejercicio de calificación, un número de muestras es presentado al panel de evaluación sensorial. Su tarea es clasificarlas en orden según el grado en el cual exhiben algunas características específicas, por ejemplo concentración de sal decreciente. Usualmente, la calificación se emplea para una búsqueda preliminar. El método no proporciona diferencias individuales entre las muestras y no es apropiado para sesiones donde deben ser evaluados muchos criterios simultáneamente.
Perfil
Las pruebas descriptivas pueden ser muy simples y pueden ser empleadas para la evaluación de un sólo atributo de textura, sabor y apariencia. También se han desarrollado métodos descriptivos que pueden ser empleados para generar una descripción completa del producto pesquero. Una forma excelente de describir un producto puede efectuase mediante un perfil de sabor (Meilgaard et al., 1991). El Análisis Descriptivo Cuantitativo proporciona una descripción detallada de todas las características del sabor en forma cuantitativa y cualitativa. El método también puede ser usado para textura. A los miembros del panel se les entrega una amplia selección de muestras de referencia y las muestras son empleadas para crear una terminología que describe el producto.
En Lyngby ha sido desarrollado un análisis sensorial descriptivo para aceite de pescado usando el MIC. Se emplea un panel entrenado de 16 jueces. Se utilizan términos como: a pintura, a almendra, a hierba, metálico; para describir el aceite en una escala de intensidad. Como referencia se emplea la puntuación fija otorgada a un aceite de pescado ligeramente oxidado.
Cuadro 8.4 Perfil de un aceite de pescado
| Sabor | Estánd. |
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| Pescado fresco | 2 |
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| Aminas | 1 |
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| A combustible | 3 |
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| Dulce | 2 |
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| Metálico | 3 |
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| A hierba/pasto | 3 |
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| A pintura | 2 |
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| Afrutado | 2 |
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| Observaciones |
| Sabor como un todo (0 inaceptable -9 neutro) | 6 |
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Para correlacionar estadísticamente, atributos individuales al deterioro oxidativo en el aceite de pescado, se emplea el Análisis Multivariable Avanzado. Los resultados pueden ser reportados en una "tela de araña" (véase Figura 8.5). El panel utiliza una escala de intensidad que normalmente va de 0 a 9.
Los perfiles pueden ser usados para toda de clase de productos pesqueros, inclusive para pescado fresco cuando se presta especial atención a un atributo en particular.
Los resultados del MIC pueden ser analizados estadísticamente usando análisis de varianza o análisis multivariable (O'Mahony, 1986).
Estadísticas
En cualquier experimento, incluyendo análisis sensorial, el diseño experimental (como: número de miembros en el panel, número de muestras, aspectos de tiempo, hipótesis a probar) y los principios estadísticos deben ser planificados con anticipación. La omisión de esta etapa generalmente ocasiona insuficiencia de datos o experimentos no concluyentes. Una guía de los métodos estadísticos más usados puede verse en Meilgaard et al. (1991). Un panel empleado para pruebas descriptivas consta, preferiblemente, de por lo menos 8-10 personas, y debe recordarse que la prueba resulta estadísticamente más fuerte si se realiza en duplicado. Generalmente, esto puede ser difícil al emplear análisis sensorial en pescados pequeños. Así, el experimento debe incluir suficiente número de muestras para eliminar las fuentes de variación, y la prueba debe ser completamente aleatoria. Para mayor información véase O'Mahony (1986) y Smith (1989).
Figura 8.4 Perfiles de sabor de un aceite de pescado después de 2 semanas de almacenamiento a diferentes temperaturas (Rorbaek et al., 1993)
Formación de asesores
La formación de asesores para la evaluación sensorial resulta necesaria en casi todos los métodos sensoriales. El grado de capacitación depende de la dificultad y la complejidad de la evaluación. Por ejemplo, para la elaboración de perfiles es necesario una profunda formación; mediante la presentación de grandes rangos de muestras a fin de obtener definiciones apropiadas de los asesores y uso equivalente del sistema de puntuación. La prueba triangular normalmente requiere un menor grado de capacitación.
El control sensorial de la calidad generalmente es efectuado por unas cuantas personas, en el mercado de pescado cuando se compra el pescado o en la inspección de la calidad. La experiencia de estas personas les permite calificar el pescado. Al comenzar como inspector de pescado no es necesario conocer todos los métodos de evaluación sensorial descritos en libros de texto (Meilgaard et al., 1991), pero deben conocerse algunos de los principios básicos. El asesor debe estar entrenado en sabores básicos y en los sabores más comunes del pescado; debe también aprender la diferencia entre olores/sabores extraños y descompuesto/contaminado. Este conocimiento puede ser proporcionado en un curso de formación básica de 2 días.
Para el trabajo experimental en compañías grandes, se requiere la formación posterior del panel sensorial con el fin de obtener un panel objetivo. Un panel de laboratorio debe tener de 8 a 10 miembros, la formación y la evaluación de los miembros del panel debe repetirse regularmente.
Instalaciones
Las instalaciones requeridas para la evaluación sensorial están descritas en libros de textos sobre evaluación sensorial.
Los requisitos mínimos para la evaluación son: un cuarto de preparación y un cuarto para servir las muestras. Los cuartos deben estar bien ventilados y tener buena iluminación (Howgate, 1994). Debe existir suficiente espacio sobre las mesas para la inspección de muestras de pescado crudo.
Cocción y presentación de las muestras
Las muestras de productos pesqueros no deben ser inferiores a 50-100 g por persona. Los filetes pueden ser servidos en lomos y deben ser cocidos hasta una temperatura interior de 65 °C. Las muestras deberán ser mantenidas ligeramente calientes al servir, por ejemplo en contenedores con aislamiento o en un plato caliente. El pescado puede ser tratado con calor mediante vapor en un baño de agua, empacado en envases herméticos ("pouche") de plástico o de aluminio. También puede emplearse un horno (microondas o de vapor) para el tratamiento de calor. El pescado puede ser empacado en plástico o puede ser colocado en un pequeño plato de porcelana cubierto con papel de aluminio. Para lomos de bacalao (2,5 x 1,5 x 6cm), en un plato de porcelana cubierto con papel de aluminio, el tiempo de cocción en un homo de vapor ("convectomate") a 100 °C debe ser 10 minutos. Las muestras deben ser codificadas antes de ser servidas.
El atractivo de los métodos bioquímicos y químicos, en la evaluación de la calidad de los productos pesqueros, está relacionado con la capacidad para establecer estándares cuantitativos. El establecimiento de niveles de tolerancia, a través de indicadores químicos de deterioro, eliminaría la necesidad de sustentar en opiniones personales las decisiones relacionadas con la calidad del producto. Por supuesto, en la mayoría de los casos los métodos sensoriales son de mucha utilidad para identificar productos de muy buena o de baja calidad. De esta forma, los métodos bioquímicos/químicos pueden ser usados para resolver temas relacionados con la calidad marginal del producto. Además, los indicadores bioquímicos/químicos han sido usados para reemplazar los métodos microbiológicos que consumen gran cantidad de tiempo. Estos métodos objetivos deben, sin embargo, mostrar correlación con las evaluaciones sensoriales de la calidad y, además, el compuesto químico a ser medido debe incrementar o disminuir de acuerdo al nivel de deterioro microbiológico o de autólisis. También es importante que el compuesto a medir no pueda ser afectado por el procesamiento (por ejemplo, degradación de aminas o nucleótidos en el proceso de enlatado como resultado de las altas temperaturas).
A continuación se muestran brevemente algunos de los procedimientos de mayor utilidad para la medición objetiva de la calidad de los productos pesqueros. Woyewoda et al., (1986) han elaborado un manual de procedimientos (incluyendo la composición proximal de los productos pesqueros).
Aminas - Bases volátiles totales
La determinación de bases volátiles totales (BVT) es uno de los métodos más ampliamente usado en la evaluación de la calidad de los productos pesqueros. Es un término general que incluye la medición de trimetilamina (producida por deterioro bacteriano), dimetilamina (producida por enzimas autolíticas durante el almacenamiento en congelación), amoniaco (producido por desaminación de aminoácidos y catabolitos de nucleótidos) y otros compuestos nitrogenados básicos volátiles asociados con el deterioro de los productos pesqueros. A pesar de que los análisis de BVT son relativamente simples de realizar, generalmente reflejan sólo los últimos estadios del deterioro avanzado y son generalmente considerados poco confiables para la medición del deterioro durante los primeros diez días de almacenamiento del bacalao enfriado, como también de otras especies (Rehbein y Oehlenschlager, 1982). Son particularmente útiles para la medición de la calidad en cefalópodos como el calamar (LeBlanc y Gill, 1984), en la pesca industrial para harina y ensilado (Haaland y Njaa, 1988), y en crustáceos (Vyncke, 1970). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que los valores de BVT no reflejan el modo de deterioro (bacteriano o autolítico), y los resultados dependen en gran medida del método de análisis. Botta et al. (1984) encontraron poca concordancia entre seis procedimientos de BVT publicados. La mayoría depende de la destilación de las aminas volátiles o de la microdifusión de un extracto (Conway, 1962); el último método es el más popular en el Japón. Para un examen comparativo de los procedimientos más comunes usados en el análisis de BVT, véase Botta et al., (1984).
Amoniaco
El amoniaco se forma por degradación bacteriana/desaminación de proteínas, péptidos y aminoácidos. También es producido por la degradación autolítica del adenosina monofosfato (AMP, Figura 5.4) en productos marinos enfriados. A pesar de que el amoniaco ha sido identificado como un componente volátil en una variedad de pescados en deterioro, unos pocos estudios han, de hecho, reportado la cuantificación de este compuesto desde que fue posible determinar su contribución relativa al incremento en las bases volátiles totales.
Recientemente, dos métodos muy convenientes para identificar específicamente amoniaco han sido puestos a disposición. El primero involucra el uso de la enzima glutamato deshidrogenasa, NADH y alfa-cetoglutarato. La reducción molar del NH3 en un extracto de pescado rinde un mol de ácido glutámico y NAD, el cual puede ser vigilado convenientemente por medición de la absorbancia a 340 nm. El equipo para la determinación de amoniaco, basado en glutamato deshidrogenasa, se encuentra actualmente disponible de Sigma (San Luis, Missouri, Estados Unidos) y Boehringer Mannheim (Mannheim, Alemania). Un tercer tipo de equipo para la determinación de amoniaco se encuentra disponible en forma de tira (Merck, Darmstadt, Alemania), la cual cambia de color cuando se coloca en contacto con extractos acuosos que contienen amoniaco (ion amonio). LeBlanc y Gill (1984) usaron una modificación del procedimiento de la glutamato deshidrogenasa para determinar semi-cuantitativamente los niveles de amoniaco sin emplear un espectrofotómetro, empleando un compuesto cuya coloración cambia de acuerdo a la siguiente reacción:
Figura
donde INT es iodontrotetrazolium y MTT es 3-[4,5 dimetiltiazol-2-il] 2,5 difenil bromuro tetrazolium
Se ha encontrado que el amoniaco es un excelente indicador de la calidad del calamar (LeBlanc y Gill, 1984) y constituye la mayor proporción del valor de BVT del calamar de aleta corta enfriado (Figura 8.7). Sin embargo, el amoniaco pareciera ser de mayor utilidad para predecir los cambios finales de la calidad, en lo que a peces de escama se refiere. En el caso del bacalao en hielo, LeBlanc (1987) encontró que los niveles de amoniaco no incrementaban sustancialmente hasta el decimosexto día de almacenamiento. Pareciera que, por lo menos para el arenque, los niveles de amoniaco incrementan más rápidamente que los niveles de trimetilamina (TMA), los cuales tradicionalmente han sido usados para reflejar el crecimiento de las bacterias del deterioro en especies de pescados demersales magros. De esta forma, el amoniaco se presenta como un indicador objetivo potencial de la calidad para pescados que se degradan primariamente por la vía autolítica en lugar de la vía microbiológica.
Figura 8.7 Efecto del tiempo de almacenamiento sobre la producción de amoniaco. BVT y TMA, en calamar de aleta corta (Illex illecebrosus), adaptado de Gill (1990).
Trimetilamina (TMA)
La trimetilamina es una amina volátil pungente, generalmente asociada con el olor típico "a pescado" del pescado en deterioro. Su presencia en el pescado en deterioro es debido a la reducción bacteriana del óxido de trimetilamina (OTMA), el cual está naturalmente presente en el tejido vivo de muchas especies de pescados marinos. Se cree que la TMA es generada por la acción de las bacterias del deterioro, sin embargo, su correlación con el número de bacterias no es generalmente muy buena. Actualmente se piensa que este fenómeno es debido a la presencia de un pequeño número de bacterias "específicas del deterioro", las cuales no siempre representan la mayor proporción de la flora bacteriana total pero son capaces de producir grandes cantidades de compuestos relacionados con el deterioro como la TMA. Uno de estos organismos específicos del deterioro, Photobacterium phosphoreum, genera aproximadamente 10-100 veces la cantidad de TMA producida por el organismo deteriorante más comúnmente conocido, Shewanella putrefaciens (Dalgaard, 1995).
Como se mencionó anteriormente, la TMA no es un indicador particularmente bueno de la calidad comestible del arenque pero resulta de utilidad, como un medio rápido, para medir objetivamente la calidad comestible de muchos pescados demersales marinos. La correlación entre el nivel de TMA, o preferiblemente el índice de TMA (donde el índice de TMA = log (1 + valor de TMA)), y la calidad comestible ha sido excelente en algunos casos (Hoogland, 1958; Wong y Gill, 1987). La Figura 8.8 ilustra la relación entre la puntuación en olor y el nivel de TMA para bacalao en hielo. El coeficiente linear de la determinación fue estadísticamente significativo a un nivel de P£ 0.05.
Figura 8.8 Relación entre la puntuación en olor y los niveles de TMA para bacalao en hielo. La línea recta fue determinada mediante análisis de regresión linear (P^ 0.05) y todos los puntos corresponden a promedios de datos obtenidos de tres bacalaos diferentes. Adaptado de Wong y Gill (1987)
La mayor ventaja del análisis de TMA, con respecto a la determinación del número de bacterias, es que puede ser realizado mucho más rápidamente y generalmente refleja más acertadamente el grado de deterioro (según pruebas organolépticas) que los recuentos bacterianos. Por ejemplo, incluso filetes de alta calidad cortados con un cuchillo de fileteado contaminado pueden tener altos recuentos bacterianos. Sin embargo, en este caso las bacterias no han tenido oportunidad de causar deterioro, de este modo los niveles de TMA tienen que ser forzosamente bajos. Las mayores desventajas del análisis de TMA radican en que: no refleja los estadios primarios de deterioro y sólo es confiable en ciertas especies de pescados. Una palabra de precaución en relación con la preparación de las muestras de pescado, para el análisis de aminas. La TMA y muchas otras aminas se volatilizan a pH elevado. La mayoría de los métodos analíticos, propuestos hasta la fecha, comienzan con un paso de desproteinación que involucra homogeneización en ácido perclórico o tricloroacético. La volatilización de las aminas presentes en las muestras puede ocasionar serios errores de análisis. Por lo tanto, las muestras deben ser neutralizadas a pH 7 inmediatamente antes del análisis y deben permanecer en su forma ácida, dentro de contenedores sellados, cuando deban ser almacenadas por extensos períodos de tiempo antes del análisis. También es importante remarcar que debe emplearse protección adecuada para manos y ojos cuando se manipule ácido perclórico o tricloroacético. Además, el ácido perclórico presenta peligro de ignición cuando entra en contacto con materia orgánica. Las salpicaduras deben ser lavadas con abundante agua. Algunos de los métodos de análisis reportados hasta la fecha incluyen colorimetría (Dyer, 1945; Tozawa, 1971), cromatografía (Lundstrom y Racicot, 1983; Gill y Thompson, 1984) y análisis enzimático (Wong y Gill, 1987; Wong et al,. 1988), por nombrar sólo algunos. Para una revisión más profunda de las técnicas analíticas para TMA véase los artículos de Gill (1990, 1992).
Dimetilamina (DMA)
Según lo señalado en la Sección 5.2, ciertos tipos de pescados contienen una enzima, la OTMA dimetilasa (OTMA-asa), que convierte el OTMA en cantidades equimolares de DMA y formaldehído (FA). Así, para los peces de la familia del bacalao (gádidos), la DMA es producida junto con el FA durante el almacenamiento en congelación, con el concomitante endurecimiento de las proteínas inducido por el FA. La cantidad de proteína desnaturalizada es aproximadamente proporcional a la cantidad de FA/DMA producida, pero es más común vigilar la calidad de los pescados gádidos, almacenados en congelación, mediante la medición de DMA. Mucho del FA se une al tejido, así deja de ser extraible y no puede ser medido cuantitativamente. El método más común para el análisis de la DMA es su determinación colorimétrica en extractos de pescado desproteinizados. El procedimiento de Dyer y Mounsey (1945) continúa actualmente en uso, aunque puede resultar más útil el ensayo colorimétrico propuesto por Castell et al. (1974) para la determinación simultánea de la DMA y la TMA, dado que ambos compuestos están generalmente presentes en el pescado congelado de deficiente calidad. Desgraciadamente, muchos de los métodos colorimétricos propuestos hasta la fecha carecen de especificidad cuando las muestras presentan mezclas de diferentes aminas. Los métodos cromatográficos, incluyendo la cromatografía gas-líquido (Lundstrom y Racicot, 1983) y la cromatografía líquida de alto desempeño (Gill y Thompson, 1984), son algo más específicos y no son tan propensos a las interferencias como los métodos espectrofotométricos. De igual forma, la mayoría de los métodos propuestos hasta la fecha para el análisis de aminas son destructivos y no muy adecuados para analizar un gran número de muestras. El análisis de los compuestos volátiles que emanan del producto, mediante cromatografía de gas, ha sido propuesto como una alternativa no destructiva para la determinación de aminas; sin embargo, todos los métodos propuestos presentan serias limitaciones prácticas.
La dimetilamina es producida autolíticamente durante el almacenamiento congelado. En pescados gádidos, como la merluza, se ha encontrado que puede servir como un indicador confiable del endurecimiento inducido por el formaldehído (Gill et al., 1979). Por estar asociada con las membranas del músculo, su producción se incrementa por la manipulación tosca y por las fluctuaciones de temperatura durante el almacenamiento en frío. La dimetilamina tiene poco o ningún efecto en el sabor o la textura del pescado per se, pero es un indicador indirecto de la desnaturalización de las proteínas, generalmente ocasionada con la manipulación inapropiada antes y/o durante el almacenamiento congelado.
Aminas biógenas
El músculo del pescado es un medio muy propicio para la formación bacteriana de una amplia variedad de aminas, como resultado de la descarboxilación directa de los aminoácidos. La mayoría de las bacterias del deterioro, que poseen actividad descarboxilasa, son activas en respuesta al pH ácido, presumiblemente para elevar el pH del medio de crecimiento a través de la producción de aminas.
La histamina, la putrescina, la cadaverina y la tiramina son producidas a partir de la descarboxilación de la histidina, ornitina, lisina y tirosina, respectivamente. La histamina ha recibido mayor atención desde que ha sido asociada con incidentes de envenenamiento por escómbridos relacionados con el consumo de atún, caballa, mahi-mahi (dorado del Hawaii). Sin embargo, la ausencia de histamina en escómbridos (atún, caballa, entre otros) no garantiza la salubridad del producto; el deterioro durante el almacenamiento, a temperaturas de enfriamiento, no siempre resulta en la producción de histamina. Mietz y Karmas (1977) propusieron un índice de calidad química basado en las aminas biógenas, indicadoras de la pérdida de la calidad en el atún enlatado, donde:
Ellos encontraron que cuanto más incrementa el índice de la calidad, más decrece la puntuación sensorial del producto enlatado. Posteriormente, Farn y Sims (1987) estudiaron la producción de histamina, cadaverina y putrescina en atún listado y atún aleta amarilla a 20°C y encontraron que la cadaverina y la histamina incrementan exponencialmente después de una fase inicial de demora de 48 horas. Los niveles de cadaverina e histamina incrementaron hasta niveles máximos de 5-6 m g/g de atún, pero los autores reportaron que la ausencia de estas aminas en el producto crudo o cocido no necesariamente significa que el producto no está deteriorado.
Es interesante notar que la mayoría de las aminas biógenas son estables al proceso térmico, por lo tanto, su presencia en productos enlatados terminados es una buena indicación de que la materia prima estaba deteriorada antes de la cocción.
Algunos de los métodos para el análisis de aminas biógenas incluyen cromatografía líquida de alta presión (Mietz y Karmas, 1977), cromatografía de gas (Staruszkiewicz y Bond, 1981), espectrofluorometría (Vidal-Carou et al., 1990) y un método enzimático rápido recientemente desarrollado para histamina, usando un lector de microplaca (Etienne y Bregeon, 1992).
Catabolitos de nucleótídos
En la Sección 5.2 - Cambios Autolíticos, se presentó una discusión sobre el análisis de los catabolitos de nucleótidos, aunque todos los cambios metabólicos no son únicamente debido a la autólisis. La mayoría de las enzimas involucradas en la degradación de la adenosina trifosfato (ATP) a inosina monofosfato (IMP) se consideran autolíticas en la mayoría de los casos, mientras que la conversión de IMP a inosina (Ino) y después a hipoxantina (Hx) se cree es debido principalmente a bacterias del deterioro, aunque se ha demostrado que la Hx se acumula lentamente en el tejido del pescado estéril. Dado que el nivel de cada catabolito intermediario incrementa o disminuye dentro del tejido, a medida que progresa el deterioro, la evaluación de la calidad nunca debe estar basada en los niveles de un solo metabolito, dado que el análisis no puede discriminar sobre la base de un solo componente si el mismo está aumentando o disminuyendo. Por ejemplo, si el contenido de IMP en una muestra de pescado se determina en 5 m moles/gramo de tejido, la muestra bien puede haber sido tomada de un pescado muy fresco como de un pescado en el limite del deterioro, dependiendo de si la AMP está o no presente.
De este modo, casi siempre se recomienda el análisis completo del perfil de nucleótidos. El análisis completo de los catabolitos de nucleótidos puede ser completado, empleando un extracto de pescado, en 12-25 minutos usando el sistema de cromatografía liquida de alta presión (CLAP), equipado con una bomba y un detector espectrofotométrico (longitud de onda de 254 nm). Quizá la técnica CLAP más simple publicada hasta la fecha sea la propuesta por Ryder (1985).
Otras aproximaciones han sido propuestas para el análisis individual o combinaciones de catabolitos de nucleótidos, pero ninguna es más confiable que la CLAP. Una palabra de precaución en relación con el análisis cuantitativo de los catabolitos nucleótidos; la mayoría de los métodos propuestos hasta la fecha involucran desproteinización de las muestras de pescado mediante extracción con ácido perclórico y tricloroacético. Es importante que los extractos ácidos sean neutralizados con una base (generalmente hidróxido de potasio) inmediatamente después de la extracción, para prevenir la degradación de los nucleótidos en el extracto. Los extractos neutralizados parecen ser muy estables incluso si se mantienen congelados por varias semanas. Una de las ventajas de usar el ácido perclórico es que el ion perclorato es insoluble en la presencia de potasio. De esta forma, neutralizar con KOH es un método conveniente de "limpieza" de la muestra antes del análisis CLAP, este procedimiento ayuda a extender la vida de la columna CLAP. También, debe notarse que la determinación de nucleótidos en pescado enlatado no refleja necesariamente los niveles en la materia prima. Gill et al. (1987) encontró recuperaciones del 50, 75, 64 y 92 por ciento para patrones de AMP, IMP, Ino y Hx, añadidos en atún enlatado antes del proceso térmico.
Algunos métodos inusuales, pero innovadores, que utilizan ensayos enzimáticos han sido propuestos durante años y son presentados en el Cuadro 8.3. Todos los métodos hasta la fecha se basan en destrucción de la muestra (homogeneización del tejido). Debe tenerse en consideración que independientemente del método, las enzimas se desnaturalizan con el tiempo y por ende los equipos de prueba, las tiras cubiertas de enzimas y los electrodos o sensores tienen una duración limitada, no así la técnica CLAP.
Cuadro 8.3 Prueba de Frescura en Pescado usando Tecnología Enzimática
| Análisis | Principio | Ventajas | Desventajas | Referencia |
| Hx | · enzimas (xantina oxidasa, XO) inmovilizadas en una
· simple de usar tira de ensayo | · rápido
· simple de usar fuera del laboratorio | · semicuantitativo
· solamente puede medir Hx (estados finales del deterioro) | Jahns et al. (1976) |
| Hx, Ino | · ensayo en tira, con enzimas inmovilizadas | · rápido
· simple de usar fuera del laboratorio | · semicuantitativo
· baja reproducibilidad
· limitado a Hx e Ino (estados finales del deterioro) | Ehira et al.(1986) |
| IMP, Ino, Hx | · enzima cubierta con electrodo de oxígeno | · rápido
· exacto | · más complicado y consume más tiempo que la tecnología de la prueba mediante tira | Karube et al.(1984) |
| Indice-K | · ensayo de enzima acoplado "KV-101 Medidor de Frescura" | · rápido
· resultados comparables a CLAP | · deben adquirirse enzimas y reactivos
· ¿costo? | · disponible comercialmente de Orienta Electric, Niiza Saitama 352, Japón |
| Indice-K | · enzima cubierta con electrodo de oxígeno "Microfresh" | · rápido
· resultados comparables a CLAP | · ¿costo? | · disponible comercialmente de Pegasus Instruments, Agincourt, ON, Canadá |
Se ha demostrado que factores como la especie, temperatura de almacenamiento y ruptura física del tejido, afectan el patrón de degradación de nucleótidos. Adicionalmente, dado que la degradación de nucleótidos refleja la acción combinada de las enzimas autolíticas y la acción bacteriana, las bacterias del deterioro afectan sin duda los patrones de nucleótidos. La selección del nucleótido, o la combinación de nucleótidos, a ser medidos debe efectuarse cuidadosamente. Por ejemplo, en algunos casos uno o dos de los catabolitos cambian rápidamente durante el almacenamiento en frío, mientras que los componentes restantes pueden cambiar muy poco. La literatura técnica debiera ser consultada como guía sobre el tema. Un excelente panorama sobre los factores biológicos y tecnológicos que afectan los catabolitos de nucleótidos, como indicadores de la calidad, me presentado por Frazer Hiltz et al. (1972).
Etanol
El etanol ha sido usado por muchos años como un indicador objetivo para la calidad de los productos pesqueros, a pesar de no ser tan común como el análisis de TMA. Dado que el etanol puede ser obtenido a partir de carbohidratos por fermentación anaeróbica (glucólisis), y/o desaminación y descarboxilación de aminoácidos como la alanina, es un metabolito común a una gran variedad de bacterias. Ha sido usado para medir objetivamente la calidad de una variedad de pescados, incluyendo atún enlatado (Iida et al., 1981a, 1981b; Lerke y Huck, 1977), salmón enlatado (Crosgrove, 1978; Hollingworth y Throm, 1982), atún crudo (Human y Khayat, 1981), gallineta nórdica, abadejo, lenguado y bacalao (Kelleher y Zall, 1983).
Hasta la fecha, el medio más simple y quizá el más confiable para medir etanol en el tejido de pescado es el uso del equipo para la prueba de enzima comercial, disponible de Boehringer Mannheim (Alemania) o de Diagnostic Chemicals (Charlottetown, P.E.I, Canadá). La ventaja de emplear etanol como indicador de deterioro es su estabilidad al calor (a pesar de ser volátil) y puede ser usado para evaluar la calidad de productos pesqueros enlatados.
Medida de la rancidez oxidativa
Los ácidos grasos, altamente insaturados, presentes en los lípidos del pescado (Sección 4.2) son muy susceptibles a la oxidación (sección 5.4). Los productos primarios de la oxidación son los lípidos hidroperóxidos. Estos compuestos pueden ser detectados por métodos químicos, generalmente haciendo uso de su potencial de oxidación para oxidar yoduro a yodo o para oxidar hierro (II) a hierro (III). La concentración de hidroperóxidos puede ser determinada mediante titulación o mediante métodos espectrofotométricos, obteniéndose el valor de peróxido (VP) como miliequivalentes (mEq) de peróxido por 1 kg de grasa extraída del pescado. Lea (1952) describe un método para la determinación del VP y Stine et al.(1954) otro para la determinación, por espectrofotométria, del hierro (III) tiocianato. Los métodos para la determinación del VP tienen una base empírica, así, las comparaciones entre valores de peróxido sólo son posibles para resultados obtenidos mediante métodos idénticos.
Por ejemplo, el método del tiocianato puede arrojar valores 1,5-2 veces mayores que el método de titulación con yodo (Barthel y Grosch, 1974).
Debido algunas razones, la interpretación del VP como un índice de la calidad no proporciona un resultado directo. Primero: los hidroperóxidos carecen de olor y sabor, de esta forma el VP no está relacionado con la calidad sensorial del producto analizado. Sin embargo, el valor de peróxido puede indicar un potencial para la formación posterior de compuestos sensorialmente objetables. Segundo: los lípidos hidroperóxidos se descomponen con el tiempo. Un VP bajo, durante un cierto punto del almacenamiento, puede indicar tanto una fase temprana de autoxidación como una fase tardía, o también un producto severamente oxidado donde la mayoría de los hidroperóxidos han sido degradados (Kranner y Rosenthal, 1992), por ejemplo en pescado seco salado (Smith et al., 1990).
Durante los estados posteriores de la oxidación generalmente están presentes los productos secundarios de la oxidación y, por lo tanto, indican una historia de oxidación. Estos productos (Sección 5.4) comprenden aldehídos, cetonas, ácidos grasos de cadena corta y otros; muchos de los cuales tienen olores y sabores desagradables, que combinados producen el carácter "a pescado rancio" asociado con los lípidos oxidados del pescado. Algunos de los productos secundarios de la oxidación aldehídica reaccionan con el ácido tiobarbitúrico, formando un producto de coloración rojiza que puede ser determinado mediante espectrofotometría. Usando este principio, pueden medirse las sustancias que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico (TBA-RS). Existen algunas variaciones del método; un método para lípidos de pescado es descrito por Ke y Woyewoda (1979), y para pescado por Vyncke (1975). Los resultados son expresados en función del patrón (di-)aldehído empleado (malonaldehído) y reportados como micromoles de malonaldehído presentes en 1 gramo de grasa (Una nota de precaución: algunas veces los resultados de TBA pueden ser expresados como mg de malonaldehído en 1 gramo de grasa, o como cantidad de malonaldehído (m mol o ag) en relación a la cantidad de tejido analizado). Algunos trabajos (como el de Hoyland y Taylor (1991) y el de Raharjo et al. (1993)) indican alguna correlación entre TBA-RS y evaluaciones sensoriales, pero otros autores no encontraron una correlación (como Boyd et al., 1993). De este modo, es necesaria cierta precaución en la interpretación de los valores de TBA-RS, en relación con las mediciones de la calidad sensorial.
Asumiendo que el VP no ha disminuido debido a un extenso almacenamiento o exposición a altas temperatura, su valor (por titulación iodométrica) no debiera ser superior a 10-20 meq/kg de grasa de pescado (Connell, 1975).
A continuación algunos ejemplos directrices para los valores de TBA-RS: productos con TBA-RS superiores a 1-2 m mol de eq.-malonaldehído por gramo de grasa (Connell, 1975) o por encima de 10 m mol de eq.-malonaldehído por 1 kg de pescado (Ke et al., 1976) probablemente presentan olor rancio.
Los métodos instrumentales modernos permiten una mayor definición en el análisis de los productos de oxidación (hidroperóxidos específicos, contenido actual de malonaldehído). Pero para las estimaciones de la calidad general, se prefieren métodos que permitan determinar un amplio rango de productos de oxidación (como el VP y el TBA-RS), a pesar de que estos métodos tienen sus limitaciones según lo discutido anteriormente. El análisis de los compuestos volátiles, productos de la oxidación que se encuentran en interfase sobre la superficie del producto, proporciona resultados que se correlacionan muy bien con la evaluación sensorial (como en el caso del bagre (Freeman y Hearnsberger, 1993)), pero el método requiere de un cromatógrafo de gases.
Propiedades eléctricas
Desde hace tiempo se sabe que las propiedades eléctricas de la piel y de los tejidos cambian después de la muerte y podrían proporcionar un medio para medir los cambios post mortem o el grado de deterioro. Sin embargo, se han encontrado muchas dificultades para desarrollar un instrumento destinado a tal fin, por ejemplo: las variaciones de las especies; la variación dentro de un mismo lote de pescado; diferentes lecturas del instrumento cuando el pescado está dañado, congelado, fileteado, desangrado o no desangrado; y una correlación deficiente entre la lectura del instrumento y el análisis sensorial. Se sostiene que la mayoría de estos problemas están superados con el GR Torrymeter (Jason y Richards, 1975). Sin embargo, el instrumento no es capaz de medir la calidad o frescura de un solo pescado, no obstante puede tener aplicación en la calificación de lotes de pescado, según se muestra en la Figura 8.9.
Figura 8.9 Relación entre las lecturas del GR Torrymeter de varias especies de pescado y la frescura, adaptado de Cheyne (1975)
Hasta hace algún tiempo, ningún instrumento había sido capaz de determinar la calidad "en línea", a pesar de que este tipo de evaluación mecanizada sería altamente deseable en las plantas de procesamiento. El desarrollo del Calificador de Frescura RT comenzó en 1982, y para 1990 estaba disponible un modelo de producción capaz de clasificar 70 pescados por minuto, en 4 canales. La empresa Rafagnataekni Electronics (Reykjavik, Islandia) desarrolló el modelo basado en la unidad sensora en el GR Torrymeter.
pH y Eh
Se sabe el que pH de la carne de pescado proporciona cierta valiosa información acerca de su condición. Las mediciones se llevan a cabo mediante un pH-metro, colocando los electrodos (vidrios calomel) directamente dentro de la carne o dentro de una suspensión de la carne de pescado en agua destilada. Las mediciones de Eh no se realizan habitualmente, pero es probable que un ensayo de frescura pueda estar basado en este principio.
Medida de la textura
La textura es una propiedad muy importante del músculo de pescado, ya sea crudo o cocido. El músculo del pescado puede tornarse duro como resultado del almacenamiento en congelación, o suave y blando debido a la degradación autolítica. La textura puede ser vigilada organolépticamente, pero por muchos años ha existido la necesidad de desarrollar una prueba reológica confiable que pueda reflejar en forma precisa la evaluación subjetiva de un panel de jueces bien entrenados. Gill et al. (1979) desarrollaron un método para evaluar el endurecimiento del músculo de pescado congelado, inducido por el formaldehído. El método empleaba un Instron, Modelo TM, equipado con una celda de corte Kramer, con cuatro cuchillas de corte. Con este método se obtiene una buena correlación con los datos obtenidos de un panel de textura entrenado. Johnson et al. (1980), reportan un método designado como "deformación a la compresión" para medir la dureza o la suavidad de la carne de pescado. Una muestra, exactamente cortada, se comprime por medio de un émbolo y se registra la curva de esfuerzo a la deformación. El módulo de deformación se calcula mediante el gráfico registrado. Otro método investigado por Dunajski (1980), mide la fuerza de corte de la carne de pescado. De este trabajo se concluye que puede emplearse una de celda de fuerza de corte, de hoja delgada del tipo Kramer.
Estos son sólo algunos de los ejemplos citados en la literatura y, hasta recientemente, todos requerían de equipos costosos y destrucción de muestras. Así, Botta (1991) desarrolló un método rápido, no destructivo, para medir la textura de filetes de bacalao. Consiste de un pequeño penetrómetro portátil, que mide tanto la firmeza como la elasticidad. Cada prueba toma sólo 2-3 segundos y el resultado parece correlacionar bien con la calificación subjetiva de la textura.
La finalidad del análisis microbiológico de los productos pesqueros es evaluar la posible presencia de bacterias u organismos de importancia para la salud pública, y proporcionar una impresión sobre la calidad higiénica del pescado, incluyendo el abuso de temperatura e higiene durante la manipulación y el procesamiento. En general, los resultados microbiológicos no proporcionan ninguna información sobre la calidad comestible y la frescura del pescado. Sin embargo, según lo señalado en los Capítulos 5 y 6, el número de bacterias específicas del deterioro está relacionado con el tiempo de duración remanente y esto puede ser predecido a partir del número de bacterias (véase Figura 5.8).
Los análisis bacteriológicos tradicionales son laboriosos, costosos, consumen tiempo y requieren de personal capacitado en la ejecución e interpretación de los resultados. Es recomendable que este tipo de análisis sea limitado en número y en extensión. Durante la última década han sido desarrollados varios métodos microbiológicos rápidos y procedimientos automatizados, que pueden ser empleados cuando se debe analizar un gran número de muestras.
Recuento total
Este parámetro es sinónimo de Recuento Total de Aeróbicos (RTA, del inglés Total Aerobic Count, TAC) y Recuento Estándar en Placa (REP, del inglés Standard Plate Count, SPC). El recuento total representa, si se efectúa mediante métodos tradicionales, el número total de bacterias capaces de formar colonias visibles en un medio de cultivo a una temperatura dada. Este dato es difícilmente un buen indicador de la calidad sensorial o de la expectativa de duración del producto (Huss et al., 1974). En percha del Nilo, almacenada en hielo, el recuento total fue de 109 ufc/g por días antes de que el pescado mera rechazado (Gram et al., 1989). En productos pesqueros ligeramente preservados los recuentos altos prevalecen por largos períodos de tiempo antes de ser rechazados. Si el recuento es efectuado luego de un muestreo sistemático y un profundo conocimiento de la manipulación del pescado antes del muestreo (condiciones de temperatura, empaque, entre otros), puede proporcionar una medida comparativa del grado general de contaminación bacteriana y de higiene aplicada. Sin embargo, también debe tomarse en consideración que no existe correlación entre el recuento total y la presencia de cualquier bacteria de importancia para la salud pública. Un resumen de los diferentes métodos empleados para el pescado y los productos pesqueros se muestra en el Cuadro 8.4.
El sustrato más comúnmente usado para los recuentos totales continúa siendo el agar para recuento en placa (ARP), del inglés "plate count agar" (PCA). Sin embargo, cuando se examinan diferentes tipos de productos pesqueros, un agar más rico en nutrientes (Agar hierro, Lyngby, Oxoid) proporciona recuentos significativamente mayores que el ARP (Gram, 1990). Además, el agar hierro proporciona mayor número de bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno, las cuales constituyen bacterias específicas del deterioro en algunos productos pesqueros. Las temperaturas de incubación iguales o superiores a 30 °C son inapropiadas cuando se examinan productos pesqueros mantenidos a temperaturas de enfriamiento. Es relevante emplear siembra en profundidad y 3-4 días de incubación a 25 °C cuando se examinan productos donde los organismos más importantes son psicrótrofos, mientras los productos donde los psicrofílicos Photobacterium phosphoreum aparecen deberán ser analizados por siembra en superficie y temperatura máxima de incubación a 15 °C.
Se han efectuado algunos intentos con el fin de facilitar los procedimientos para la determinación del contenido de bacterias (Fung et al., 1987). Tanto Redigel (RCR Scientific) como Petrifilmä SM (Compañía 3M), son agares deshidratados con un agente gelificante al cual se adhiere directamente la muestra. La principal ventaja del Redigel y el Petrifilm, comparados con los recuentos tradicionales en placa (en adición al costo), es su fácil manipulación. Sin embargo, todos los métodos basados en agar comparten una desventaja común debido al prolongado período de incubación requerido.
El examen microscópico del alimento es una forma rápida de estimar los niveles bacterianos. Mediante un microscopio de contraste de fase, el nivel de bacterias en una muestra puede ser determinado dentro de una unidad logarítmica. Una célula por campo de visión equivale a aproximadamente 5.105 ufc/ml, a una magnificación de 1000x. La tinción de las células con naranja acridina y su detección mediante microscopía de fluorescencia ha ganado una amplia aceptación, al igual que la técnica epifluorescente de filtración directa (TEFD; del inglés: direct epifluorescence filter technique, DEFT). Los métodos microscópicos son muy rápidos, sin embargo, la baja sensibilidad debe ser considerada como su mayor desventaja.
El número de bacterias en el alimento también ha sido estimado midiendo la cantidad de adenosina trifosfato (ATP) de origen bacteriano (Sharpe et al., 1970), o midiendo la cantidad de endotoxinas (bacterias Gram-negativas) mediante la prueba Limulus amoebocito lisato LAL (Gram, 1992). El primero es muy rápido pero existen dificultades en separar el ATP bacterial del ATP de origen somático.
Cuadro 8.4 Métodos para la determinación del contenido de bacterias en productos pesqueros
| Método | Temperatura (°C) | Incubación | Sensibilidad (ufc/g) |
| Recuento en placa o Agar hierro | 15-25 | 3-5 días | 10 |
| "Redigel'/"Petrifilmä SM" | 15-25 | 3-5 días | 10 |
| Microcolonias - TEFD | 15-30 | 3-4 horas | 104 -105 |
| TEFD | - | 30 min. | 104 -105 |
| ATP | - | 1 hora | 104 -105 |
| Prueba Limulus lisato (LAL) | - | 2-3 horas | 104 -104 |
| Microcalorimetría/ | 15-25 | 4-40 horas | 10 |
| Reducción colorimétrica |
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| Conductancia/capacitancia |
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Algunos métodos (microcalorimetría, reducción colorimétrica, conductancia y capacitancia) usados para la estimación rápida del número de bacterias se basan en la toma de una muestra, incubación a altas temperaturas (20-25 °C) y detección de una señal determinada. En el método microcalorimétrico, el calor generado por la muestra es comparado con un control estéril. La determinación de la conductancia y la capacitancia consiste en la medición y registro de los cambios en las propiedades eléctricas de la muestra, comparada con una muestra control estéril. El tiempo que transcurre antes de que ocurra algún cambio significativo en el parámetro medido (calor, conductancia, entre otros) se denomina Tiempo de Detección (TD). El tiempo de detección está inversamente relacionado al número inicial de bacterias, por ejemplo, una reacción temprana indica un alto recuento bacteriano en la muestra. Sin embargo, a pesar de que la señal obtenida es inversamente proporcional al recuento bacteriano efectuado mediante agar, sólo una pequeña fracción de la microflora genera la señal y deben tomarse precauciones en la selección de la temperatura de incubación y el sustrato.
Bacterias del deterioro
El número total de bacterias en el pescado raramente indica calidad sensorial o duración en almacén (Huss et al., 1974). Sin embargo, se reconoce que ciertas bacterias son las principales causantes del deterioro (véase Sección 5.3). Diferentes sustratos ricos en peptona y que contienen citrato férrico, han sido usados para la detección de bacterias productoras de H2S como la Shewanella putrefaciens, las cuales aparecen como colonias negras debido a la precipitación del FeS (Levin, 1968; Gram et al., 1987). El deterioro ambiental es causado generalmente por miembros de la familia Vibrioanaceae, los cuales también forman colonias negras en agar hierro al cual se añade una fuente de sulfato orgánico (como el Agar Hierro, Lyngby). No existe un medio selectivo o indicativo para Pseudomonas spp., contaminante de algunos pescados de agua dulce tropical, ni para Photobacterium phosphoreum que contamina el pescado empacado. En el Laboratorio Tecnológico de Lyngby, actualmente se desarrolla un método basado en conductancia para la detección específica de P. phosphoreum (Dalgaard, comunicación personal). La presencia, o ausencia, de bacterias patógenas es generalmente evaluada mediante métodos basados en técnicas inmunológicas o de biología molecular. Estas técnicas pueden también ser desarrolladas para bacterias específicas del deterioro; el Laboratorio Tecnológico ha estado actualmente investigando el uso de anticuerpos específicos para S. putrefaciens (Fonnesbech et al., 1993). También ha sido desarrollada una prueba de genes, específica para S. putrefaciens, pero no ha sido probada en productos pesqueros (DiChristina y DeLong, 1993).
Reacciones de deterioro
Algunas reacciones de deterioro pueden ser usadas para evaluar la situación bacteriológica de los productos pesqueros. Según lo descrito anteriormente, han sido desarrollados agares en los cuales es posible el recuento de organismos productores de H2S. Durante el deterioro del pescado magro de carne blanca, una de las principales reacciones de deterioro es la reducción bacteriana del óxido de trimetilamina a trimetilamina (Liston, 1980; Hobbs y Hodgkiss, 1982). Cuando el OTMA es reducido a TMA, ocurren algunos cambios físicos: disminuye el potencial redox, el pH incrementa y la conductancia eléctrica incrementa. La medición de estos cambios, en un sustrato rico en OTMA inoculado con la muestra, puede ser usada para evaluar el nivel de organismos con potencial de deterioro; así, cuanto más rápido ocurre el cambio mayor es el nivel de organismos del deterioro.
Algunos autores han inoculado una cantidad conocida de muestra en un sustrato con OTMA y han registrado el tiempo transcurrido hasta que ocurre un cambio significativo en la conductancia (Gibson et al., 1984; Gram, 1985; Jorgensen et al., 1988). Se ha encontrado que el tiempo de detección es inversamente proporcional al número de bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno, en pescado fresco almacenado aerobicamente; una estimación rápida de su número puede ser suministrada en 8-36 horas.
Los cambios del potencial redox en un sustrato que contiene OTMA pueden ser registrados por electrodos u observando el color de un indicador redox (Huss et al., 1987); y también mediante determinaciones conductimétricas, el tiempo transcurrido hasta que se registre un cambio significativo es inversamente proporcional a la cantidad inicial de bacterias.
Bacterias patogénicas
Algunas bacterias patogénicas pueden estar presentes en el ambiente o contaminar el pescado durante la manipulación. Una descripción detallada de estos organismos, su importancia y métodos de detección es proporcionada por Huss (1994).
REFERENCIAS
http://www.fao.org/DOCREP/v7180s/v7180s09.htm
El color inadecuado de la superficie en carnes rojas es una causa común de insatisfacción del consumidor y es costoso para la industria cárnica.
